BIOCHECK bc-1301操作方法

BIOCHECK Inc.是新抗體發現和免疫測定開發服務的綜合提供商。

PD-1 ENZYME IMMUNOASSAY TEST KIT   Catalog Number: BC-1301

pd-1酶免疫測定試劑盒   目錄編號：bc-1301

酶免疫法定量測定人血清和血漿中Pd-1濃度

只作研究用途

不適用于診斷程序

介紹

程序性細胞死亡蛋白1(pd-1，CD 279，pdd 1)是一種細胞表面受體，是調節T細胞炎癥活動和維持免疫外周耐受的關鍵。 系統(1)。pd-1可以與配體pd-l1和pd-l2t相互作用。pd-1具有胞外IGV結構域、跨膜結構域和胞內尾部兩個磷酸化位點(shp-1和shp-2)。 o下調免疫系統，抑制T細胞活性(2)。抗原識別后，活化的T細胞在其表面表達pd-1，產生干擾素，誘導pd的表達。 -L1，從而促進細胞凋亡或細胞死亡。(3)當被腫瘤細胞劫持時，pd-1配體的異常表達抑制免疫調節的T細胞活化，導致疾病進展。 （表示方向）向 (4).

血清和血漿中Pd-1水平升高與類風濕關節炎和皮膚硬化有關(5，6)。Pd-1主要由腫瘤浸潤的T細胞(7)表達.進一步區域 研究表明，使用針對pd-1免疫檢查點的單克隆抗體有助于在理解和治療黑色素瘤和其他vario等癌癥方面取得突破性進展。 美國非小細胞肺癌(4)。

測定原理

pd-1酶聯免疫吸附試驗是以固相酶聯免疫吸附試驗為基礎的.該檢測系統使用了針對不同抗原決定的*的單克隆抗體對。 pd-1分子上的NT。用一種小鼠抗PD-1單克隆抗體進行固相固定(在微滴度井上).另一種與辣根堿結合的單克隆抗pd-1抗體 過氧化物酶(HRP)存在于酶的共軛溶液中。測試樣本被允許與這兩種抗體依次反應，導致pd-1分子被夾在固體ph之間。 ASE和酶解抗體。在室溫下進行兩次單獨的60分鐘孵育后，用洗滌緩沖液沖洗水井，除去未結合的標記抗體。添加了TMB試劑 D在黑暗條件下孵育20分鐘，形成藍色。隨著停止解決方案的添加，顏色開發停止，將顏色更改為黃色。c Pd-1的濃度與樣品的顏色強度成正比.在450 nm處分光度法測定吸光度。

提供的試劑和材料

抗體包被井(1板，96井)微滴度井，用小鼠單克隆抗pd-1包被。

含防腐劑的磷酸鹽緩沖液-BSA溶液中50 ng/ml Pd-1標準品(0.5 mL/小瓶)

標準稀釋劑和樣品稀釋劑(30 mL/瓶，1瓶)含有含防腐劑的磷酸鹽緩沖液-bsa溶液。

酶結合試劑(12 mL/小瓶，1小瓶)含有與辣根過氧化物酶結合的小鼠單克隆抗pd-1。

20倍洗滌劑磷酸鹽緩沖液(50 mL/瓶，1瓶)

TMB試劑(11 mL/瓶，1瓶)含有一步TMB溶液。

停液(11 mL/瓶，1瓶)含有稀釋鹽酸(1NHCl)

貯藏條件

將未打開的工具包保存在2-8°C，收到后，當它沒有使用，直到到期顯示在工具包標簽上。有關過期日期，請參閱包標簽。

將微滴度板放在一個裝有干燥劑的密封袋中，以盡量減少對潮濕空氣的暴露。

 試劑準備

1.所有試劑在使用前應允許達到室溫(18-25°C)。

2.對于每次測試運行，準備一個新的標準集。

3.用標準/樣品稀釋劑稀釋50~10 ng/mL。用標準/樣品稀釋劑制備10 ng/mL標準的雙倍系列稀釋劑：

a.10納克/毫升：0.12毫升50納克/毫升0.48毫升標準品/樣品稀釋劑

b.5納克/毫升：0.25毫升10納克/毫升標準品/樣品稀釋劑

c.2.5納克/毫升：0.25毫升5納克/毫升標準品/樣品稀釋劑

1.25ng/mL：0.25毫升2.5納克/毫升標準品/樣品稀釋劑

e.0.625 ng/mL：1.25ng/mL標準品/樣品稀釋劑0.25mL

f.0.313 ng/mL：0.25mL/0.625 ng/mL標準品/樣品稀釋劑2

標準稀釋劑0.156 ng/mL：0.313 ng/mL 0.25mL

i.0 ng/mL：0.25 mL標準稀釋劑

5.病人樣本在使用前需要稀釋4倍。制備一系列小管(即1.5 mL微離心管)，將60L血清與180 L標準/樣品稀釋劑混合。

6.工作洗滌緩沖器：從20倍庫存中制備1倍洗滌緩沖液。加入50毫升的20倍洗滌緩沖液庫存到950毫升的直接水。工作洗滌緩沖液在2~8°C溫度下穩定運行30天.注：任何晶體 這可能是由于高鹽濃度的存在，必須在室溫下再溶解，然后再進行稀釋。

檢測程序

準備標準。見試劑準備。

稀釋樣品1：4稀釋。見試劑準備。

確保所需數量的涂層井在保持架。

配發Pd-1標準的100mL，并將樣品稀釋到適當的井中.

室溫(18-25°C)孵育60 min.

將培養皿中的內容物倒入廢容器中，將孵化器中的混合物移除。用300mL工作水洗緩沖液沖洗微滴水井5次。把水井打到吸水紙或紙上 r毛巾去除所有殘留水滴。

將Pd-1工作酶結合劑的100mL配伍到每口井中.

室溫(18-25°C)孵育60 min.

將培養皿中的內容物倒入廢容器中，將孵化器中的混合物移除。用300 ul工作水洗緩沖液沖洗微滴水井5次。把水井打到吸水紙或紙上 r毛巾去除所有殘留水滴。

在每口井中分配100mL TMB溶液。

室溫(18-25°C)孵育20分鐘.

通過在每口井中加入100mL的停止溶液來停止反應。

輕輕攪拌30秒。重要的是要確保所有的藍色*變成黃色。

14.在450 nm處讀取吸光度，15分鐘內使用微滴度良好的閱讀器。

統計

計算每組參考標準、對照和樣品的平均吸光度值(OD 450)。

通過繪制每個參考標準的平均吸光度(以納克/毫升為單位)繪制在圖表紙上，并在垂直(Y)軸和濃度上繪制一條標準曲線。 在水平(X)軸上。

用每個樣品的平均吸光度值，從標準曲線上測定相應的Pd-1濃度(ng/mL)。視經驗和/或計算機可用情況而定 可以使用其他的數據縮減方法。

樣品的檢出值應乘以稀釋倍數為4，得到Pd-1的結果為ng/ml。

標準曲線實例

一個典型的標準運行結果，吸光度讀數在450 nm處顯示在Y軸上，而pd-1濃度顯示在X軸上。注：這條標準曲線是為了說明 僅用于計算未知數，不應用于計算未知數。每個實驗室必須在每個實驗中生成自己的數據和標準曲線。

工作特性

敏感，感受性

用2SD法測定的Pd-1酶聯免疫吸附試驗的低檢出濃度為0.15ng/ml。

度，準確（性）

1. 在一次測定中，通過對三種不同樣品的重復測定，確定了內測精密度.批內可變性如下所示：

b.在一系列單獨校準的測試中，通過對三個不同樣本的重復測量，確定了運行間精密度。批間變異顯示b。 below在下面，到下面

1.回收率和線性研究。回收樣品加入已知的Pd-1水平，并一式兩份進行測定。平均回收率為105.3%。

b. 對三個樣品進行連續稀釋，以確定線性度。平均回收率為99.6%。

參考

費夫，B.T.，&Pauken，K.E.(2011年)。PD-1通路在自身免疫和外周耐受中的作用。“紐約科學院年鑒”，1217(1)，45-59。

Riella，L.V.，Paterson，A.M.，Sharpe，A.H.，&Chandraker，A.(2012)。PD-1通路在免疫應答中的作用。美國移植雜志：美國社會雜志 移植和美國移植外科醫生協會，12(10)，2575-2587。

Zak，Krzysztof&Kitel，Rados?aw&Przetocka，Sara&Golik，Przemys?aw&Guzik，Katarzyna&Musielak，Bogdan&D mling，Alexander&Dubin，Grzegorz&Holak，Tad。(2015年)。胡氏情結結構 人類編程死亡1，pd-1，及其配體PD-L1。結構。23.。10.1016/j.str.2015.09.010。

Zoran Gatalica，卡麗·斯奈德，托德·馬尼，阿納托爾·加扎爾普爾，丹尼爾·霍特曼，年青肖，佩吉·奧夫伯格，因加羅斯，加吉·巴蘇，塞米爾·弗拉尼茨，亨利·林奇，丹尼爾·馮霍夫和奧米德·哈米 d.程序化細胞死亡1(PD-1)及其配體(PD-L1)在常見癌癥中的作用及其與分子腫瘤類型的關系。癌癥流行病學研究2014年12月1日(23)(12)2965-2970。

Greisen，S.，Rasmussen，T.，Stengaard-Pedersen，K.，Hetland，M.，H rselv-Petersen，K.，Hvid，M.，&Deleuran，B.(2013年)。可溶性程序性死亡1(spd-1)的增加與疾病活動有關。 早期類風濕關節炎的影像學進展。斯堪的納維亞風濕病學雜志，43(2)，101-108。

Yanaba，K.，Hayashi，M.，Yoshihara，Y.，&Nakagawa，H.(2016)。系統性硬化癥患者血清可溶性程序性死亡-1和程序性死亡配體-1水平與皮膚硬化程度的關系 。皮膚科雜志，43(8)，954-957。

7.Ahmadzadeh，M.，Johnson，L.A.，Heemskerk，B.，Wunderlich，J.R.，Dudley，M.E.，White，D.E.，&Rosenberg，S.A.(2009年)。腫瘤抗原特異性CD8 T細胞浸潤腫瘤高表達水平 Pd-1的LS和功能受損。血液，114(8)，1537-1544。