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DENARASE®ELISA試劑盒

更新時(shí)間：2020-12-08 點(diǎn)擊次數(shù)：2370

DENARASE®ELISA試劑盒

用戶說明

DENARASE ELISA試劑盒

ELISA法測(cè)定工藝衍生樣品中的沙雷菌核酸內(nèi)切酶。

僅供研究和生產(chǎn)使用。

將可能含有粘質(zhì)沙雷氏菌核酸內(nèi)切酶的樣品在預(yù)包被有

特異性單克隆捕獲抗體以及不同核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線

預(yù)期用途

濃度。孵育和清洗后-

該ELISA試劑盒預(yù)期用于體外定量測(cè)定粘質(zhì)沙雷氏菌核酸內(nèi)切酶。該檢測(cè)可用于監(jiān)測(cè)從工藝相關(guān)樣品中去除核酸內(nèi)切酶，如DENARASE®或Benzonase*核酸酶，以用于工藝開發(fā)和質(zhì)量控制目的。該試劑盒僅供研究和生產(chǎn)使用，不預(yù)期用于診斷程序。

試驗(yàn)原理

該DENARASE ELISA試劑盒是一種夾心ELISA，在微量檢測(cè)板形式中進(jìn)行。

在除去未結(jié)合組分的步驟中，加入生物素結(jié)合的特異性單克隆檢測(cè)抗體。進(jìn)一步洗滌步驟后，結(jié)合的檢測(cè)抗體與作為示蹤劑的酶結(jié)合物反應(yīng)。終清洗步驟后，向孔中加入底物溶液并反應(yīng)，導(dǎo)致顯色。采用光度測(cè)定法測(cè)量光密度，其與孔中的分析物濃度成正比。可根據(jù)相應(yīng)的DENARASE標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知樣品中的核酸內(nèi)切酶濃度。

表1：試劑盒中提供的試劑和材料

No. 試劑詳細(xì)信息數(shù)量

1 微量檢測(cè)板（即用型）

96孔（12條/8孔），用粘質(zhì)沙雷氏菌核酸內(nèi)切酶特異性單克隆抗體預(yù)包被

5個(gè)微孔板

3 稀釋緩沖液(10×)

含有表面活性劑和防腐劑的Tris緩沖鹽水，10×濃縮液

1 × 20 mL

5 檢測(cè)抗體(100×)

在含有防腐劑的緩沖溶液中，與生物素結(jié)合的粘質(zhì)沙雷氏菌核酸內(nèi)切酶特異性單克隆抗體，

100×濃縮液

1 × 0.75 mL

7 底物溶液 TMB One底物溶液，即用型 1 × 75 mL

需要但未隨兒童提供的材料和設(shè)備

用于稀釋清洗緩沖液和稀釋緩沖液的超純水（至少雙蒸水）（以10×濃縮液的形式提供）

用于清除微量測(cè)試平板清洗后殘留液體的吸水紙巾

用于制備標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品的適當(dāng)試管

適用于清洗和稀釋緩沖液的容器

適用于有效多通道移液的試劑槽

孵育步驟期間覆蓋微量檢測(cè)板的蓋子

定軌微量測(cè)定板振蕩器（約500 rpm）和渦旋混合器

Microtest洗板機(jī)（也可以手動(dòng)清洗）

精密移液器（可調(diào)體積，10 μL至5000 μL），帶適當(dāng)槍頭

帶適當(dāng)槍頭的多通道移液器(100 μL)

試劑的儲(chǔ)存

提供的所有試劑均應(yīng)在2 ℃-10 ℃下冷藏保存，并應(yīng)在失效日期前使用。

警告和注意事項(xiàng)

本試劑盒僅供研究和生產(chǎn)使用，僅應(yīng)使用

由有資質(zhì)的人員進(jìn)行。

開始測(cè)定前，請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書。

記錄批號(hào)和失效日期。請(qǐng)勿混合不同批次的試劑。請(qǐng)勿使用過期試劑。

遵循藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范和安全性指南。必要時(shí)穿戴實(shí)驗(yàn)服、一次性手套和防護(hù)鏡。

試劑制備

使用前將所有試劑和樣本恢復(fù)至室溫。

清洗緩沖液的制備(1×)

使用前，用超純水以10×(2)1:10的比例對(duì)清洗緩沖液進(jìn)行潤(rùn)滑（例如，100 mL 10×濃度溶液與900 mL超純水混合）。洗滌緩沖液(1×)在室溫下可穩(wěn)定儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)兩周。

制備的稀釋度緩沖液 (1×)使用前用超純水以1:10稀釋10×濃縮液緩沖液(3)（例如，10 mL 10×濃縮液用90 mL超純水稀釋）。以下

稀釋緩沖液(1×)在室溫下可穩(wěn)定儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)2周。

試劑盒中的一些試劑含有Proclin®300 DENARASE標(biāo)準(zhǔn)品的制備

作為防腐劑。這些試劑可能引起眼睛和皮膚刺激，應(yīng)謹(jǐn)慎處理。如果接觸眼睛或皮膚，立即用水沖洗。

避光儲(chǔ)存底物溶液。

終止液由0.5摩爾硫酸組成。該試劑具有腐蝕性，可能引起眼睛和皮膚刺激。應(yīng)小心處理。如果接觸眼睛或皮膚，立即用水沖洗。

應(yīng)將剩余的試劑盒試劑和制備的溶液視為具有潛在危害。

符合國(guó)家的安全指南和法規(guī)的廢物。

DENARASE ELISA的標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)在進(jìn)行測(cè)定前即刻使用試劑盒提供的DENARASE標(biāo)準(zhǔn)品(4)制備。標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)僅在制備當(dāng)天使用。

根據(jù)以下稀釋方案，在稀釋緩沖液(1×)中制備DENARASE ELISA標(biāo)準(zhǔn)品（pdi和S1-S8）：

標(biāo)準(zhǔn)品

濃度

抗原體積[μL] 體積稀釋

ID [pg/ml]μL of

緩沖液[μL]

標(biāo)準(zhǔn)品

PD：預(yù)稀釋；S：標(biāo)準(zhǔn)品

制備檢測(cè)抗體工作溶液(1×)

稀釋檢測(cè)抗體100×濃縮液

(5) 用稀釋緩沖液(1×)以1:100稀釋。對(duì)于一個(gè)微量檢測(cè)板，將120 μL 100×濃縮液與12 mL稀釋緩沖液混合。該工作溶液應(yīng)僅在制備當(dāng)天使用。

酶結(jié)合物工作溶液的制備(1×)

稀釋酶結(jié)合物100 x濃縮液

(6) 用稀釋緩沖液(1×)以1:100稀釋。對(duì)于一個(gè)微量檢測(cè)板，將120 μL 100x濃縮液與12 mL稀釋緩沖液混合。該工作溶液應(yīng)僅在制備當(dāng)天使用。

樣品制備

應(yīng)通過離心去除樣品中存在的任何聚集體，以確保適當(dāng)?shù)姆治鲂阅堋?/p>

一般而言，所有樣品工作稀釋液應(yīng)僅在制備當(dāng)天使用。

測(cè)定前，應(yīng)使用稀釋緩沖液(1×)稀釋樣本。小樣品稀釋度應(yīng)為1:2。

試驗(yàn)程序

所有ELISA步驟均在室溫(18 ℃-26 ℃)下進(jìn)行

使用前，使試劑盒中的所有材料和試劑達(dá)到室溫。

在達(dá)到室溫之前，請(qǐng)勿打開預(yù)包被微孔板(1)的箔袋。

試驗(yàn)中未使用的剩余平板條應(yīng)重新裝入含干燥劑的袋中。密封袋子，用于冷藏儲(chǔ)存。在所有孵育步驟中，平板應(yīng)蓋上蓋子（試劑盒未提供），以防止溶液蒸發(fā)和污染。

1. 培養(yǎng) 其中標(biāo)準(zhǔn)品和樣品：用100 μL/孔的DENARASE標(biāo)準(zhǔn)品和試驗(yàn)對(duì)照品填充微孔板，作為稀釋樣品，并在500 rpm下連續(xù)振蕩孵育1小時(shí)。標(biāo)準(zhǔn)品、試驗(yàn)對(duì)照品和樣品應(yīng)至少重復(fù)分析兩次。建議一式三份。

2. 清洗：

除去微孔內(nèi)容物，用250 μL/孔的清洗緩沖液(1×)清洗微孔板4次。清洗后，倒置平板以倒出孔中的內(nèi)容物。吸干并在干凈的吸水紙上用力敲擊，丟棄任何殘留液體。

3. 用檢測(cè)抗體孵育：

7. 用底物溶液孵育并終止：

加入100 μL/孔的底物溶液(7)，連續(xù)振蕩孵育15 min。如果15 min后顯色過低，底物孵育時(shí)間可延長(zhǎng)至30 min。通過直接加入100 μL/孔的終止液(8)終止顯色反應(yīng)，得到黃色產(chǎn)物。

8. 測(cè)量：

用多通道酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度(OD450)。

推薦參考波長(zhǎng)在620 nm和690 nm之間。

用100 μL/孔的檢測(cè)器填充微孔板

抗體工作液(1×)和孵育液

連續(xù)振搖0.5小時(shí)。

4. 清洗：

取出孔中的內(nèi)容物并清洗

平板4×，250 μL/孔的清洗緩沖液(1×)。清洗后，倒置平板以倒出孔中的內(nèi)容物。吸干并在干凈的吸水紙上用力敲擊，丟棄任何殘留液體。

5. 用酶結(jié)合物孵育：

向平板中加入100 μL/孔的酶結(jié)合物工作溶液(1×)，孵育20 min，期間不斷振搖。

6. 清洗：

取出孔中的內(nèi)容物并清洗

平板4×，250 μL/孔的清洗緩沖液(1×)。清洗后，倒置平板以倒出孔中的內(nèi)容物。吸干并在干凈的吸水紙上用力敲擊，丟棄任何殘留液體。

計(jì)算

計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品重復(fù)OD450值的平均值。借助適當(dāng)?shù)能浖?chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，好使用四參數(shù)或五參數(shù)方程的非線性回歸模式。根據(jù)校準(zhǔn)曲線計(jì)算的未知樣本濃度必須乘以樣本的稀釋因子。

ELISA性能特征

分析靈敏度

檢測(cè)限(LOD)定義為可與分析空白區(qū)分的低核酸內(nèi)切酶濃度，經(jīng)計(jì)算約為4 pg/ml。通過計(jì)算內(nèi)切核酸酶濃度測(cè)定檢測(cè)限，該濃度對(duì)應(yīng)于高于分析空白平均OD450三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的OD450值。

在對(duì)應(yīng)于三倍LOD的濃度下確認(rèn)了定量限(LOQ)。LOQ為12 pg/ml。

工作范圍

DENARASE ELISA的工作范圍定義為32 pg/ml至1000 pg/ml核酸內(nèi)切酶。

注：基于2018年10月生成的數(shù)據(jù)。

故障排除

以下列出了分析性能不充分的可能原因。

A.整個(gè)平板中無反應(yīng)性省略孵育步驟或試劑以錯(cuò)誤順序使用試劑ELISA組分制備不充分-