PHAGOTEST試劑盒使用說明

1. 試劑盒簡介
PHAGOTEST試劑盒，用于定量檢測全血中白細(xì)胞吞噬功能。試劑盒中包括FITC熒光標(biāo)記的調(diào)理大腸桿菌，細(xì)胞發(fā)生吞噬作用對FITC標(biāo)記的大腸桿菌進(jìn)行攝取。采用流式細(xì)胞儀測定具有吞噬功能的細(xì)胞（粒細(xì)胞和單核細(xì)胞）總百分以及細(xì)胞的吞噬活性（每個細(xì)胞吞噬的細(xì)菌數(shù)目）。
試劑盒可以考察藥物是否引起機體細(xì)胞吞噬作用改變。異常的吞噬作用通常會發(fā)生在多種臨床疾病，例如，中性粒細(xì)胞自身缺陷，免疫球蛋白及補體缺陷等。先天性缺陷，例如白細(xì)胞整合素缺陷，肌動蛋白功能障礙等，均會到導(dǎo)致感染的風(fēng)險增加以至于引起中性粒細(xì)胞吞噬功能的缺陷。獲得性缺陷相關(guān)的吞噬作用的改變通常發(fā)生在外科創(chuàng)傷，糖尿病，腎衰竭，全身性感染和急性胰腺炎等。吞噬功能的降低還會發(fā)生在燒傷感染的病人，AIDS病人，老年人，新生兒，采用糖皮質(zhì)激素或者麻醉藥治療的病人等。
在一些體外或者體內(nèi)試驗中，可以觀察到多種免疫調(diào)節(jié)劑，例如白介素-2，干擾素-γ，植物提取素等可以增強中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬功能。
試劑盒不僅適用于人的血樣，同樣也適用于大小鼠，兔，狗，牛及其他種屬。
2. 材料和試劑
2.1 試劑盒包括以下試劑
? REAG A（ 試劑A）
1x洗液：將1整瓶REAG A粉末溶解在1L的雙蒸水中。
? REAG B（試劑B）
1瓶（2mL），1x濃度的穩(wěn)定且用FITC標(biāo)記的調(diào)理大腸桿菌（E.coli），大約2x109個菌/mL。
? REAG C（試劑C）
1瓶（10 mL），1x濃度的淬滅溶液，用于淬滅在細(xì)胞外的細(xì)菌熒光表達(dá)，藍(lán)色溶液。
? REAG D（試劑D）
1瓶（20 mL）的裂解液（10x儲備液濃度）。在使用前用雙蒸水按1:10進(jìn)行稀釋，配制成1x的裂解液，用于裂解紅細(xì)胞和固定白細(xì)胞。
? REAG E（試劑E）
1瓶（20 mL），1x濃度的DNA染液（粉色溶液），用于流式細(xì)胞儀分析時區(qū)別細(xì)菌和白細(xì)胞。

儲存條件和穩(wěn)定性：試劑盒需要在2-8℃避光條件。使用前將大腸桿菌（REAG B）充分渦旋混勻或者用針抽吸使其分散。試劑內(nèi)含有防腐劑，但是不會吞噬功能的檢測。試劑的有效期同試劑盒包裝上標(biāo)明一致。
2.2 試劑盒未包括以下材料，但需要準(zhǔn)備
? 血液采集用的肝素化抗凝管。
? 12x75 mm的一次性試管（BD公司的Falcon管，貨號：352052）和合適數(shù)量的試管架。
? 500 mL和1000 mL的試劑瓶，用于保存1x洗液和1x裂解液。
? 帶蓋的冰浴盒。
? 雙蒸水或者注射用水，用于配制1x洗液和1x裂解液。
? 合適量程的移液器（20-200 μL, 100-1000 μL），一次性槍頭。
? 連續(xù)加樣器和槍頭。
? 水浴鍋。
? 數(shù)字式溫度計。
? 渦旋器
? 冷凍離心機（配有12x75 mm的吊杯）。
? 488 nm激發(fā)波長（氬離子激光）的流式細(xì)胞儀。
3. 操作過程
2.1 準(zhǔn)備
? 配制1x洗液。
? 根據(jù)測試的樣本量配制1x裂解液（試劑D）， 2mL/測試樣。
? 準(zhǔn)備冰浴。
? 預(yù)熱水浴鍋至37℃，溫度必須控制！
? 開啟流式細(xì)胞儀，用校準(zhǔn)微球（beads）進(jìn)行校準(zhǔn)。
3.2 樣本處理
3.2.1 加樣
將肝素化抗凝的全血渦旋混勻后，在5 mL試管（Falcon管）底部各加100 μL全血。一般取2支試管，其中1支為陰性對照管，另1支為測試管。將所有試管放入冰浴中10 min，使血樣降低溫度至0℃。
注意：勿將血液殘留在試管壁上。不要使用EDTA或者檸檬酸抗凝管采集全血。
3.2.2 激活
渦旋混勻已經(jīng)預(yù)冷的大腸桿菌（REAG B），每支試管（即陰性對照管和測試管）中均加入20 μL的REAG B。
3.2.3 孵育
所有試管再次混勻后，陰性對照管置于冰上；測試管則置于37°C水浴中，孵育10 min。孵育時間和溫度必須嚴(yán)格監(jiān)控，水浴箱必須蓋住
3.2.4 淬滅
孵育結(jié)束后，將同一試管架上所有樣本同時拿出水浴箱，放置于冰上阻止吞噬過程，在所有試管加入100 μL冰冷的淬滅溶液（REAG C），冰上操作，渦旋混勻。
3.2.5 洗滌
每支試管加入3 mL 1x洗液（REAG A），渦旋混勻，離心細(xì)胞（5 min，250xg，2-8°C）。去除上清液。
再洗一次。每支試管加入3 mL 1x洗液（REAG A），渦旋混勻，離心細(xì)胞（5 min，250xg，2-8°C）。去除上清液。
3.2.6 裂解和固定
每支試管加入2 mL預(yù)熱至室溫的1x 裂解液（REAG D），渦旋混勻，室溫避光孵育20 min。離心（5 min，250xg，2-8°C），去除上清液。
3.2.7 洗滌
每支試管加入3 mL 1x洗液（REAG A），渦旋混勻，離心細(xì)胞（5 min，250xg，2-8°C）。去除上清液。
3.2.8 DNA染色
每支試管加入200 μL DNA染液（REAG E），混勻，避光冰浴10 min后，在60 min內(nèi)完成流式細(xì)胞儀分析。
4. 流式細(xì)胞儀分析
采用藍(lán)綠激發(fā)光的488nm的氬離子激光器。
? 設(shè)定1個gate在FL2的直方圖（紅色熒光），圈定含有人類二倍體細(xì)胞相同DNA的細(xì)胞群（用于排除細(xì)菌，見英文原版圖Fig. A）
每個樣本收集10,000-15,000 白細(xì)胞。
? 數(shù)據(jù)評估
對發(fā)生吞噬作用細(xì)胞（粒細(xì)胞和單核細(xì)胞）的百分比和其平均熒光強度（細(xì)胞吞噬細(xì)菌數(shù)量）進(jìn)行分析。在散點圖 lin FSC/lin SSC中圈定所要檢測細(xì)胞群（粒細(xì)胞，單核細(xì)胞），見英文原版圖Fig.2A，2C；并對其綠色熒光強度的FL1的直方圖進(jìn)行分析，見英文原版圖Fig.2B，2D。
陰性對照管（在FL1坐標(biāo)軸上設(shè)定maker，使1~3%的細(xì)胞在陽性區(qū)域。
測試管中發(fā)生吞噬作用的細(xì)胞顯示在marker內(nèi)，為的陽性細(xì)胞，平均熒光強度與每個白細(xì)胞吞噬的細(xì)菌數(shù)量相關(guān)。
5. 注意事項（Remarks）
? 肝素化抗凝的全血需要在采集后24 h進(jìn)行處理，在處理前在室溫條件下保存。
? 嗜酸性粒細(xì)胞（過敏及寄生蟲感染時數(shù)量增多）顯示自體熒光增長，在0°C 時的陰性對照分析會被顯示出來。
? 吞噬細(xì)胞在37°C的大小和顆粒度會與陰性對照的樣本不同，這一點在圈定細(xì)胞區(qū)域的時候要注意。另外，細(xì)胞可能會由于在37°C條件下的自體溶解或者粘附在塑料表面而丟失減少。
? 在建立試驗方法時，采用重復(fù)管是非常有用的。
? 提供的試驗方法是在*條件下（如，調(diào)理的大腸桿菌等）考察樣本的吞噬功能。在正常人體給藥后進(jìn)行體內(nèi)或者體外吞噬功能檢測時通常只有一定程度增加。
進(jìn)行體外試驗檢測藥物作用時，可進(jìn)行時間依賴性動力學(xué)試驗（與大腸桿菌孵育2.5或者5 min）或者稀釋菌液（1：4或者1:8）
? 大腸桿菌已經(jīng)受調(diào)理素的作用過的，但是全血中的血清還會對其有一定的影響。所以當(dāng)采用除全血樣本以外的樣本，如HL-60 （人早幼粒白血病細(xì)胞），分離的單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞與大腸桿菌孵育時，孵育體系可加入5-20% 胎牛血清或者人血清。同時也可能有必要延長孵育時間（60 min-240 min）。
? 未受調(diào)理素作用的FITC標(biāo)記的大腸桿菌（REAG F，試劑盒未包括），可用于檢測病人血清使細(xì)菌受調(diào)理素作用的能力。
6. 其他限制（Limitations）
? 每個實驗室需要根據(jù)自己實驗條件建立的自己的參考值范圍。
? 樣本需要至少有95%的活細(xì)胞且需要*被抗凝。含有衰老的細(xì)胞和未*抗凝的血樣可能導(dǎo)致非特異染色，可能是由于血小板的凝集和死細(xì)胞的泄漏的DNA引起的。
? 大腸桿菌（大約4 x 107/20μL）與白細(xì)胞（在100 μL全血）的比例為50:1（假設(shè)白細(xì)胞為8000個/μL），比例為80:1（假設(shè)白細(xì)胞為5000個/μL）。當(dāng)樣本的白細(xì)胞數(shù)量與正常范圍不同時（4000-10000）需要根據(jù)其數(shù)量加入相應(yīng)數(shù)量的大腸桿菌。
? 樣本在未加入DNA染液（REAG E）上流式細(xì)胞儀檢測前，在冰上放置24 h是穩(wěn)定的，但是熒光強度會系統(tǒng)性的丟失。
7. 關(guān)于進(jìn)行定量分析的重要的說明（important instruction for quantitative analysis）
? 吞噬過程是主要依賴于溫度，所以在整個樣本處理過程中樣本的溫度，孵育條件的溫度是需要嚴(yán)格遵守。溫度計應(yīng)采用可以顯示小數(shù)點后一位的型號。
? 實驗的可重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)化操作是非常重要的，所以需要嚴(yán)格按照試劑說明書和自己改動步驟（如果有改動）進(jìn)行操作。
? 任何流式細(xì)胞儀的改動都要考慮，因為這會影響到“Geomean”的值，所以使用校準(zhǔn)微球（beads）對流式細(xì)胞儀進(jìn)行每日的校準(zhǔn)是非常有必要的。