原核表達載體現貨供應

　　原核表達載體指：能攜帶插入的外源核酸序列進入原核細胞中進行復制的載體。

  

 

編輯本段原核表達載體調控原件

1.啟動子

　　啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并起始RNA合成的序列，它是基因表達*的重要調控序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。由于細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，因此原核表達載體所用的啟動子必須是原核啟動子。 原核啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成，對mRNA的合成極為重要。在轉錄起始點上游5～10 bp處，有一段由6～8個堿基組成，富含A和T的區域，稱為Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10區。來源不同的啟動子，Pribnow 盒的堿基順序稍有變化。在距轉錄起始位點上游35 bp處，有一段由10 bp組成的區域，稱為-35區。轉錄時大腸桿菌RNA聚合酶識別并結合啟動子。-35區與RNA聚合酶s亞基結合，-10區與RNA聚合酶的核心酶結合，在轉錄起始位點附近DNA被解旋形成單鏈，RNA聚合酶使*和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后在RNA聚合酶作用下向前推進，形成新生的RNA鏈。 原核表達系統中通常使用的可調控的啟動子有Lac（乳糖啟動子）、Trp（色氨酸啟動子）、Tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動子） 、lPL （l噬菌體的左向啟動子）、T7噬菌體啟動子等。

2. SD序列

　　1974年Shine和Dalgarno首先發現，在mRNA上有核糖體的結合位點，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp處的由3～9 bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互補，是核糖體RNA的識別與結合位點。以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列，簡稱SD序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響mRNA轉錄、翻譯成蛋白的重要因素之一，某些蛋白質與SD序列結合也會影響mRNA與核糖體的結合，從而影響蛋白質的翻譯。另外，真核基因的第二個密碼子必須緊接在ATG之后，才能產生一個完整的蛋白質。

3．終止子

　　在一個基因的3¢末端或是一個操縱子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有終止轉錄功能，這一序列稱之為轉錄終止子，簡稱終止子（terminator）。轉錄終止過程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進，RNA的延伸也停止在終止信號上，完成轉錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來。對RNA聚合酶起強終止作用的終止子在結構上有一些共同的特點，即有一段富含A/T的區域和一段富含G/C的區域，G/C富含區域又具有回文對稱結構。這段終止子轉錄后形成的RNA具有莖環結構，并且有與A/T富含區對應的一串U。轉錄終止的機制較為復雜，并且結論尚不統一。但在構建表達載體時，為了穩定載體系統，防止克隆的外源基因表達干擾載體的穩定性，一般都在多克隆位點的下游插入一段很強的rrB核糖體RNA的轉錄終止子。

編輯本段原核表達載體構建

1.獲得目的基因

　?。?）通過PCR方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環獲得所需基因片段。

　?。?）通過RT-PCR方法：提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA*鏈，以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。

2.構建重組表達載體

　　（1）載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

　?。?）PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

3. 獲得含重組表達質粒的表達菌種

　　（1） 將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，根據重組載體的標志（抗Amp或藍白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑒定。

　?。?）測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

　?。?） 以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。